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5.4 Die chromatographische Methode

Die bisherigen Methoden vermögen durchweg nicht eindeutig zu
beweisen, daß es sich bei dem im Harn von Diabetikern
enthaltenen Stoff sicher um Glucose handelt, da auch andere
Stoffe süß schmecken, reduzierende Gruppen enthalten bzw. die
Ebene des polarisierten Lichtes um einen bestimmten Winkel
drehen.

Um Substanzgemische zu trennen und ihre Bestandteile zu
identifizieren eignet sich besonders die chromatographische
Methode, da der RF-Wert einer Substanz sehr charakteristisch
für diese ist. Die Identifikation wird dadurch erreicht, daß
man reine Vergleichssubstanz mitlaufen läßt. Zum Nachweis bzw.
zur Sichtbarmachung kann eine chemische Methode z.B. ein
Nachweis reduzierender Gruppen dienen, wodurch der "Kreis der
Verdächtigen" von vornherein eingeschränkt wird.

Entfernung Startpunkt bis Fleckmittelpunkt
RF Wert = ------------------------------------------
Entfernung Startpunkt Fließmittelfront

Für meine Versuche wählte ich die Zirkularmethode, einen
Spezialfall der Rundfiltermethode.

Bei der Rundfiltermethode wird das Fließmittel dem waagerecht
liegenden Papier in einem Punkt, z.B. durch einen Docht,
zugeführt. Das Substanzgemisch, das man trennen will, wird in
diesem Punkt oder in einem Kreis um diesen Punkt aufgetragen.
Sie verteilt sich schließlich während des Chromatograpierens
auf einen Kreis um diesen Punkt. Bei der Zirkularmethode teilt
man den Kreis in verschiedene Sektoren ein, so daß man in den
verschiedenen Sektoren verschiedene Substanzgemische und die
Reinsubstanz zum Vergleich unabhängig voneinander laufen lassen
kann.

Schematisch sieht dies ungefähr folgendermaßen aus.



S1 - S3 = Substanzgemisch O = Ausgangspunkt Fließmittel

S4 =Reinsubstanz

Nach diesem Schema enthält S1 die Reinsubstanz S4.
S3 enthält eine Substanz mit ähnlichem chemischen Charakter.

Für meine Versuche verwendete ich folgende Geräte.

a) Chromatographiepapier

Bei den Papieren Nr. 2040 läuft das Fließmittel schnell, bei
denen der Nr. 2043 mittelschnell, bei Nr. 2045 langsam. Je
langsamer das Fließmittel läuft, desto schärfer ist die
Trennung.

Die "b" Papiere haben ein großes Flächengewicht (g/cm2)
daher eine große Naßfestigkeit, was bei der Herausnahme eines
durchgefeuchteten Papieres von Bedeutung ist.

"Mgl" bedeutet ein bereits oberflächenglatt von der
Langsiebmaschine kommendes Papier, das in der Laufrichtung 60
cm in der Querrichtung 58 cm breit ist.

Ich verwendete das Papier Nr. 2043 b Mgl, welches für
gewöhnliche Trennung empfohlen wird und mit welchem man auch in
Schulversuchen arbeitet. Firma Schleicher u. Schull, Marke
Selectra (14,5 cm Durchmesser mit Radialschlitzen).

b) Fließmittel

Alpha) N Butanol CH3 (CH2)3 OH

Beta) Eisessig CH3 COOH (Essigsäure 100%)

Gamma) H2O

Alpha : Beta : Gamma = 4 : 1 : 5 = 20 ccm :3 ccm : 25 ccm

c) Vergleichslösung

1g Glucose in Meßkolben mit 70 ml aqua dest auflösen, 20ml abs.
Äthanol zufügen ad 100ml auffüllen.

d) Sichtbarmachung

Durch Aufsprühen von Fehling'scher Lösung mit Parfümzerstäuber.
Danach 15 min in Trockenschrank erwärmen bei ca. 100o C.

e) Weitere Geräte

1. 2 Petrischalen 14 cm Durchmesser mit ca. 60 ml
Fließmittelmenge.

2. Glaskapillaren ca. 6 cm lang zum auftragen der
Substanzflecken (leicht herzustellen durch ausziehen
von über Bunsenbrennerflamme erhitztem Glasrohr).

3. Als Docht aufgedrilltes Stück Chromatograpierpapier.

f) Laufzeit

Die Laufzeit schwankte bei den einzelnen Versuchen zwischen 1h
20 min und 1h 50 min bei einer Raumtemperatur von ca. 24o C.

g) RF - Wert

Anilinphihalat als Sprühreagenz für Chromatographie von Merk
eignete sich besser für den Glucosenachweis als die zu Anfang
verwendete Fehling'sche Lösung. Ich verwendete daher für die
weiteren Versuche diesen Indikator.

Unter Zuhilfenahme der chromatographischen Methode gelang es
mir schließlich, die im Harn des Diabetikers enthaltene
Substanz eindeutig als Glucose zu identifizieren..
Es ergab sich ein durchschnittlicher RF-Wert von 1,85.

Für die tägliche Harn- bzw Blutzuckerbestimmung ist diese
Methode jedoch vollkommen ungeeignet, Zunächst einmal, weil sie
zuviel Zeit in Anspruch nimmt, Laufzeit zwischen 1h 20 min und
1h 50 min und außerdem, weil sie viel zu störanfällig ist.

Literatur: Laborbücher Chemie
Herbert Daecke
Chromatographie



 


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Ihr Hugo R. Vogel

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